W diagnostyce boreliozy stosowane są testy IFA Immunofluorescencji lub Elisa jako podstawowe kryterium badawcze, oceniają one miano przeciwciał w klasie IgM i IgG oraz test weryfikacji Wetern blot w przypadku dodatnich wyników testami Elisa. Obserwuje się przede wszystkim dynamikę wzrostu miana przeciwciał.

W testach Elisa Borrelia s.l. IgM wykrywane są swoiste przeciwciała IgM, pojawiające się zwykle po 2-4 tygodniach od zakażenia. Wczesna reakcja odpornościowa skierowana jest głównie przeciw regionowi 14 kD flageliny i OspC (zewnętrznemu białku powierzchniowemu) co umożliwia przeprowadzenie reakcji w stopniu wysokoczułym. Białka powierzchniowe OspA, OspB i OspC są antygenami immunodominującymi, ale tylko antygen OspC indukuje wczesną odpowiedź immunologiczną. Antygen rzęskowy 14 kD wywołuje intensywną produkcję poliklonalnych przeciwciał klasy IgM i IgA. Przeciwciała przeciwko flagelinie pojawiają się na wszystkich etapach choroby i są obecne w większości surowic ludzkich. Testy Elisa IgG + VlsE wykorzystują wysoce swoisty natywny lub rekombinowany antygen Borrelia burgdorferi VlsE i lizat mieszanki antygenów, co pozwala na oznaczenie przeciwciał IgG z dużą czułością i swoistością. Najczulszą metodą diagnostyczną jest polimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR). Badanie DNA bakterii zalecane jest u pacjentów wytwarzających małe ilości przeciwciał (np. immunosupresja). Seronegatywność pod względem obecności swoistych przeciwciał dotyczy ok. 20% surowic pacjentów z podejrzeniem boreliozy.

W ostatnich latach pojawiła się możliwość oznaczania tzw. krążących kompleksów immunologicznych KKI, będących bezpośrednią przyczyną sekwestracji immunoglobulin. Metodyka opisuje wytrącanie i dysocjację KKI, a następnie w uzyskanej frakcji ponowne oznaczenie swoistych dla Borrelia burdorferi przeciwciał.

Najnowszym narzędziem diagnostycznym są testy EliSpot, zalecane w przypadkach podejrzewanej ale jednak tzw. ukrytej boreliozy. Ten rodzaj testów wykorzystuje się głownie u pacjentówz zaburzeniami w produkcji przeciwciał lub u osób z długo utrzymującymi się wartościami granicznymi parametrów oznaczanych w czasie rutynowej diagnostyki. Badanie wykonywane jest w hodowli limfocytów, które po aktywacji swoistym antygenem wydzielają cytokiny.

W przypadkach podejrzenia neuroboreliozy niezbędne jest badanie płyny mózgowo-rdzeniowego dostępnymi metodami badawczymi. Zakażenie charakteryzuje się występowaniem pleocytozy limfocytowej. Liczba komórek sięga 1000/ul i podwyższone jest stężenie białka (1-2 g/l). We wczesnej neuroboreliozie badanie płynu mógowo-rdzeniowego może dać wynik ujemny, zaś w przewlekłej może utrzymywać się jedynie nieznaczne podwyższenie białka, zatem diagnostyka jest bardzo trudna i pozostawia dużo wątpliwości.